问题：柱层析技术
类型：推荐
提问：cia1568
等级：▲
版块：基本操作、分离技术(qixie,wanghong,)
信誉：50%
回复：20
阅读：1686
时间：2005-06-28 11:32:38 编辑加入/取消收藏订制/取消短消息举报该贴

常说的过柱子应该叫柱层析分离，也叫柱色谱。我们常用的是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。
柱子可以分为：加压，常压，减压。
压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间，但是会减低柱子的塔板数。所以其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的，但是时间也最长，比如天然化合物的分离，一个柱子几个月也是有的。
减压柱能够减少硅胶的使用量，感觉能够节省一半甚至更多，但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发（有时在柱子外面有水汽凝结），以及有些比较易分解的东西可能得不到，而且还必须同时使用水泵抽气（很大的噪音，而且时间长）。以前曾经大量的过减压柱，对它有比较深厚的感情，但是自从尝试了加压后，就几乎再也没动过减压的念头了。
加压柱是一种比较好的方法，与常压柱类似，只不过外加压力使淋洗剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气，双连球或者小气泵（给鱼缸供气的就行）。特别是在容易分解的样品的分离中适用。压力不可过大，不然溶剂走的太快就会减低分离效果。个人觉得加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的。
关于柱子的尺寸，应该是粗长的最好。
柱子长了，相应的塔板数就高。柱子粗了，上样后样品的原点就小（反映在柱子上就是样品层比较薄），这样相对的减小了分离的难度。试想如果柱子十厘米，而样品就有二厘米，那么分离的难度可想而知，恐怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了。而如果样品层只有0.5厘米，那么各榉志捅冉先菀椎玫酵耆?掷肓恕５比徊捎么执蟮闹?右???冉隙?的硅胶和溶剂了，不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么了（有些不环保的说，不过溶剂回收重蒸后也就减小了部分浪费）。
现在见到的柱子径高比一般在1：5～10，书中写硅胶量是样品量的30～40倍，具体的选择要具体分析。如果所需组分和杂质分的比较开（是指在所需组分rf在0.2～0.4，杂质相差0.1以上），就可以少用硅胶，用小柱子（例如200毫克的样品，用2cm×20cm的柱子）；如果相差不到0.1，就要加大柱子，我觉得可以增加柱子的直径，比如用3cm的，也可以减小淋洗剂的极性等等。
关于无水无氧柱，适用于对氧，水敏感，易分解的产品。
可以湿柱，也可以干柱。不过在样品之前至少要用溶剂把柱子饱和一次，因为溶剂和硅胶饱和时放出的热量有可能是产品分解，毕竟要分离的是敏感的东东，小心不为过。也是因为分离的东西比较敏感，所以接收瓶一定要用可密封的，遵循schlenk操作。至于是加压、常压、减压，随需而定。因为是schlenk操作，所以点板是个问题，如果样品是显色的，恭喜了，不用点板，直接看柱子上的色带就行了。如果样品无色，只好准备几十个schlenk瓶，一瓶一瓶的点，不过几次之后就知道样品在哪，也就可以省些了。像我以前过一根无水无氧柱，需要六个schlenk，现在只一个就能把所要的全收集到。
无水无氧柱中用的比较多的是用氧化铝作固定相。因为硅胶中有大量的羟基裸露在外，很容易是样品分解，特别是金属有机化合物和含磷化合物。而氧化铝可以做成碱性、中性和酸性的，选择余地比较大，但是比硅胶要贵些。听说有个方法，就是用石英做柱子，然后用HF254做固定相，这样在柱子外面用紫外灯一照就知道产品在哪里了，没有验证过。哪位做过可以提出来大家参详参详。
※ 关于湿法、干法上样。
湿法省事，一般用淋洗剂溶解样品，也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等，但溶剂越少越好，不然溶剂就成了淋洗剂了。很多样品在上柱前是粘乎乎的，一般没关系。可是有的上样后在硅胶上又会析出，这一般都是比较大量的样品才会出现，是因为硅胶对样品的吸附饱和，而样品本身又是比较好的固体才会发生，这就应该先重结晶，得到大部分的产品后再柱分，如果不能重结晶那就不管它了，直接过就是了，样品随着淋洗剂流动会溶解的。有些样品溶解性差，能溶解的溶剂又不能上柱（比如DMF,DMSO等，会随着溶剂一起走，显色是一个很长的脱尾），这时就必须用干法上柱了。样品和硅胶的量有一种说法是1： 1，我觉得是越少越好，但是要保证在旋干后，不能看到明显的固体颗粒（那说明有的样品没有吸附在硅胶上）。
溶剂的选择。
当然是最便宜，最安全，最环保的了。所以大多选用石油醚，乙酸乙酯。文献中有写用正己烷的，太贵了，除非特别需要不要用不然银子哗哗的，流的比淋洗剂还快，不过因为极性很小，有时还是非它不可。乙醚也可以用，但是就是容易睡觉，注意保持清醒别让溶剂流干了，那样柱子也就不爽了。二氯甲烷也有用的，但是要知道，它和硅胶的吸附是一个放热过程，所以夏天的时候经常会在柱子里产生气泡，天气冷的时候会好一些。甲醇，据说能溶解部分的硅胶，所以产品如果想过元素分析的话要留神，应该经过后继处理，比如说重结晶等。其他的溶剂用的相对较少，要依个人的不同需要选择了。由于某些原因，用到的淋洗剂多是大包装的（便宜嘛），我们这里是用10升或25升的塑料桶装的，就要注意这些工业品的纯度是较低的。经常能够从送来的大桶底部看见有色的杂质，其他的杂质就可想而知了，所以在比较严格的柱分时就要对溶剂重蒸。当然过原料时就可以免去这一步了，反正下面还有提纯的方法。
另外溶剂在过柱子后最好也回收使用，一方面环保，另一方面也能节省部分经费，缺点是要消耗一定的人工。这里要注意的是，一般在过柱同时进行的是减压旋蒸，石油醚和乙酸乙酯的比例由于挥发度的不同会导致极性的变化，一般会使得极性变大，在梯度淋洗时比较合适，正好极性越来越大了。在过完柱子后，溶剂最后回收要采用常压，因为在减压旋蒸时会有部分低沸点的杂质一起出来，常压时就会减少这种现象，如果杂质和你下面要过的样品有反应那就惨了。
关于操作问题。
1 装柱。
柱子下面的活塞一定不要涂润滑剂，会被淋洗剂带到产品中的，可以采用四氟节门的。干法和湿法装柱觉得没什么区别，只要能把柱子装实就行。装完的柱子应该要适度的紧密（太密了淋洗剂走的太慢），一定要均匀（不然样品就会从一侧斜着下来）。书中写的都是不能见到气泡，我觉得在大多数情况下有些小气泡没太大的影响，一加压气泡就全下来了。当然如果你装的柱子总是有气泡就说明需要多练习了。但是柱子更忌讳的是开裂，甭管竖的还是横的，都会影响分离效果，甚至作废！
2 加样。
用少量的溶剂溶样品加样，加完后将下面的活塞打开，待溶剂层下降至石英砂面时，再加少量的低极性溶剂，然后再打开活塞，如此两三次，一般石英砂就基本是白色的了。加入淋洗剂，一开始不要加压，等溶样品的溶剂和样品层有一段距离（2～4cm就够了），再加压，这样避免了溶剂（如二氯甲烷等）夹带样品快速下行。
3 淋洗剂的选择。
感觉上要使所需点在rf0.2～0.3左右的比较好。不要认为在板上爬高了分的比较开，过柱子就用那种极性，如果rf在0.6，即使相差0.2也不容易在柱子上分开，因为柱子是一个多次爬板的状态，可以通过公式的比较：0.6/0.8一次的分离度，肯定不如（0.2/0.3 ）的三次方或四次方大。
4 样品的收集。
用硅胶作固定相过柱子的原理是一个吸附与解吸的平衡。所以如果样品与硅胶的吸附比较强的话，就不容易流出。这样就会发生，后面的点先出，而前面的点后出。这时可以采用氧化铝作固定相。
另外，收集的试管大小要以样品量而定，特别是小量样品，如果用大试管，可能一根就收到了三个样品，wuwu。如果都用小试管那工作量又太大。
5 最后的处理
柱分后的产品，由于使用了大量的溶剂，其中的杂质也会累积到产品中，所以如果想送分析，最好用少量的溶剂洗涤一下，因为大部分的杂质是溶在溶剂里的，一洗基本就没了，必要时进行重结晶。另外，再过柱的时候，有时会出现气泡，一是和使用的溶剂有关，如果是易挥发的溶剂，如乙醚、二氯甲烷等，在
室温稍高的情况下，很容易出现这种现象，因此，在室温高的时候，可以选择沸点较高，挥发相对小的溶剂。还有，使用混合溶剂时，使用的两种溶剂的沸点应该相差不大，如：乙酸乙酯和石油醚(60~90),而乙醚却要选择30－60的石油醚。二是：不论是用带砂板的还是塞棉花的，在装柱之前，都要将空气用加压方法将空气排干，这样就可避免柱中有空气！过柱子需要耐心，不要着急.

回复人：花心枫,▲ (我是做柱层析的，我想多学习啊，请支持我啊！) 时间：2006-04-18 18:06:02 编辑	1楼
不错啊。谢谢啊

回复人：自然雨,▲ () 时间：2006-06-06 15:43:54 编辑	2楼
学到了，谢谢

回复人：whgjlt,▲ () 时间：2006-06-26 21:34:27 编辑	3楼
用细硅胶（300－400）做填料时，用什么加压好？鱼泵感觉太慢了

回复人：我住村外,▲ (永远不够用——知识and人民币。) 时间：2005-06-30 12:04:15 编辑	4楼
长了知识！

回复人：lyyy111,▲ (从事药物中间体) 时间：2005-07-02 17:02:22 编辑	5楼
我正在做此实验，借此好好学习一下！！

回复人：舞旭,▲ () 时间：2005-07-03 21:55:45 编辑	6楼
真的很棒,谢谢楼主!~

回复人：botanic,▲ (植物成分提取分离鉴定) 时间：2005-07-23 21:39:59 编辑

7楼

很好！想继续学习！
1、想知道，上样硅胶是上样量的30-40倍，是体积还是质量，还是高度。
2、何谓合适的柱子长度和直径？当柱长很长时，是否层析就有问题？
3、5cm*100cm，硅胶高度70cm，是否合适？
4、每种洗脱剂的洗脱体积，应根据什么算出？如何计算？
5、比如我欲初步分离上样为50g的样品，应选用什么规格的层析柱？上样硅胶应该为多少？
急需以上问题的答复！非常感谢！

回复人：chgaoyh,▲ (从事药物研发的,愿与大家交流) 时间：2005-07-24 15:26:05 编辑	8楼
１.通常是指质量．２.这没有明文的规定，要视具体情形而定．３.我认为硅胶６０cm即可．４.这要根据过柱子前利用ＴＬＣ来确定．５.这个问题不太好回答，没有相关经验．

回复人：botanic,▲ (植物成分提取分离鉴定) 时间：2005-07-24 19:54:17 编辑	9楼
收到谢谢回答 “４.这要根据过柱子前利用ＴＬＣ来确定。”假如知道Rf值，是否可以确定柱子的长度，上样硅胶的量，洗脱体积。他们之间是不是有一种理论的数学关系！谢谢！

回复人：kez,▲▲▲ (我为人人，人人为我) 时间：2005-07-24 20:45:53 编辑	10楼
数学关系？估计很难弄。

回复人：botanic,▲ (植物成分提取分离鉴定) 时间：2005-07-25 11:04:23 编辑	11楼
好的谢谢！

回复人：llscmary,★ (参与论坛日日新，如逆水行舟，不进则退！) 时间：2005-07-26 08:30:20 编辑	12楼
多有一些这方面的经验总结就好了，谢谢了！

回复人：botanic,▲ (植物成分提取分离鉴定) 时间：2005-07-27 10:03:05 编辑	13楼
是的，希望有经验的前辈多发些这方面的帖子！

回复人：feixiang02,▲ (在读学生,在实验室做实验) 时间：2005-09-04 09:05:04 编辑	14楼
所有的柱子上面都要加石英砂吗?

回复人：whizhao,▲ (喜欢Chemistry，希望在这里和大家能够充分的交流！) 时间：2005-10-23 16:08:15 编辑	15楼
最近我也做分离的问题，蒸馏效果不怎么好，柱层析分离法可以试一下。谢谢LZ！

回复人：七月洋苏草,▲ (鸢尾化学) 时间：2005-10-23 22:41:14 编辑	16楼
很有参考价值

回复人：whau2003,▲ () 时间：2005-11-09 22:58:39 编辑	17楼
资源不错，加0.1分

回复人：Tom,▲ (Pharma) 时间：2005-11-10 11:13:39 编辑	18楼
资源不错，加0.1分

回复人：sany,▲ (银杏萜内酯的提取分离检测) 时间：2005-11-13 09:54:24 编辑	19楼
资源不错，加0.1分

回复人：sany,▲ (银杏萜内酯的提取分离检测) 时间：2005-11-13 09:57:35 编辑	20楼
我的样品只有5毫升,文献说用3克酸性氧化铝,1厘米直径的柱子,我还是不太明白该买多长的柱子,大家能给我点意见吗?

问题讨论没有结束...

您尚未进入本论坛,登录之后才可以回贴

9msec