问题：荧免疫分析的研究进展如何?
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时间：2005-07-12 20:16:59 编辑加入/取消收藏订制/取消短消息举报该贴

我想查一些有关荧光应用于DNA和免疫分析方面的综述，希望大家帮忙查一下，谢了

回复人：wangsui,▲▲▲ (我不思故我不在) 时间：2005-07-13 16:49:31 编辑	1楼
我原来做过一些荧光用于DNA测定方面的工作，但是没有做过免疫分析。感觉这个领域已经没有什么发展前途了，好像从文献上面看不到这个方面的工作了，因此我建议不要搞了，还是换其他方向的好。只是一家之言，不要见笑

回复人：qiangpeng,★★★★★ (化学百科) 时间：2005-07-18 21:24:40 编辑

2楼

人类进入21世纪，感染性疾患仍然是危害人类健康的重要疾患，尤其是对第三世界国家。WHO宣布近30年来，新发现了29种新病原体。Prion被确定为疯牛病和人类C-J等病的病原体，肯定了蛋白质颗粒可成为病原体，致使感染人类的微生物日趋复杂。常见致病微生物的威胁不但没有消除，且出现了严重的耐药问题，如葡萄球菌、肠球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、克雷白菌，给临床治疗带来巨大困难。HIV在世界范围内肆虐，STD病原微生物尚在蔓延。1993年，肺鼠疫在印度复燃，霍乱弧菌O139型有可能致成世界范围的第8次大流行。严峻的现实向微生物检验提出了更高的要求——更准确、更快速地检出与监测病原体。传统的微生物检验法的最大弱点是慢，难以适应诊断与治疗。近代，以PCR代表的分子生物学技术的发展及自动化仪器的应用已明显加快了微生物检验的速度，这些方面已有许多专著予以介绍。本文仅就微生物实验室可常规应用的技术即快速微生物检查法作一介绍。
一、直接从临床标本中检查微生物抗原。Direct detection of pathogen’s antigens or antibodies from patient’s body fluids.
　　应用单克隆抗体结合各种形式的放射免疫分析（RIA）、酶免疫分析（EIA）、荧光免疫分析（FIA）、时间分辨荧光免疫分析（TrFIA）、化学发光免疫分析（CIA）、生物发光免疫分析（BIA）等，足以检出临床标本中痕量的（10-18-10-21）微生物抗原，免去细菌或病毒培养过程，直接完成微生物感染的快速诊断。应用斑点EIA、FIA或金标法已制成商品检测卡用于淋病奈瑟氏菌，沙眼衣原体、肺炎支原体等检测，快速、直观，可由患者自行检查，但敏感性与特异性尚存在问题。Gehring将单抗结合在磁珠上，自血液中吸附伤寒杆菌，再以免疫电化学发光法（ECM）检测，可以检出8×103/ml菌体，[1]也有直接检出伤寒杆菌H或O抗原的报导。针对结合分支杆菌的表面抗原或脂阿拉伯聚糖（GAM）制成单抗，用ELISA或斑点EIA法可直接检测标本中的TB抗原。[2]Brenda等报告用ELISA法可直接检测粪便中O157型大肠杆菌抗原，应用O157的多克隆抗体包被酶标板，加入适当稀释与处理的粪便标本后，再与过氧化物酶标记的抗O157抗体结合，加底物呈色。经与细菌培养法平行检查185份标本，阴性者9份，两法一致。此法与其他肠杆菌及非O157大肠杆菌无交叉反应。[3]深部真菌感染的诊断极为困难，因自血液或体液中培养的阳性率很低。以敏感方法检查此类菌的可溶性抗原则可快速诊断，如念珠菌菌体成分中含D-阿拉伯醇和L-阿拉伯醇，自血液或体液中直接检出此种抗原，可迅速诊断深部念珠菌病。Mitsutake等比较了自39名深部念珠菌病患者血液中检出抗原的四种方法。应用斑点印迹法检查其弹力酶（Enolase）抗原的阳性率71.8%，特异性100% 。应用Latex凝集法（Cand-Tec试剂）检查热敏抗原阳性率76.9%，特异性87.5% 。应用Latex凝集法（pastrorex试剂）检查甘露聚糖抗原（Mannan）阳性率75.6%，特异性100% 。应用鲎试验检查真菌细胞壁组分β-Glucan的阳性率为84.4%，特异性为87.5% 。[4]丝状或酵母样真菌的快速抗原检查法见表1。

表1 深部真菌的抗原检查
真菌检查抗原检查技术
念珠菌（白色，热带，平滑，近平滑）弹力酶（Enolase）
热敏糖蛋白抗原
胞壁甘露聚糖斑点印迹法
Latex凝集（Card-Tac）
EIA(Behring Diagnostics)
β—Glucan 鲎试验
新型隐球菌荚膜多糖抗原 Latex凝集，ELISA
丝状真菌（1 3）β-D葡聚糖鲎试验
曲霉菌胞壁半乳甘露聚糖 (Galactomannan) Latex凝集（Sanofi Co.） (Pastrorex spergillus)
组织胞浆菌原荚膜的59-70kd抗 ELISA

　　应用敏感手段自尿液中检出微生物的可溶性抗原进行快速诊断更具吸引力。国内已有SPA协同试验自尿液中检查军团菌可溶性抗原的报道。Hackman 比较EIA法检查尿中嗜肺军团菌血清型Ⅰ型抗原，其特异性均达100%，敏感性RIA为77%，EIA为88% 。[5]自尿液检查B族链球菌可溶性抗原以诊断新生儿败血症，有应用特异性抗体的乳胶颗粒法和酶免法。不同商品试剂的敏感性达88-100%，特异性达81-100%，应用未浓缩尿的敏感性略低。[6]应用ELISA直接自尿中检出沙眼衣原体，已有商品试剂盒出现（IDEIA-Ⅲ），自尿中测定念珠菌抗原D-阿拉伯醇以及D-阿拉伯醇/L-阿拉伯醇比值，可敏感的诊断播散性念珠菌病，比细菌培养法敏感、快速。[7]检查尿中肺炎链球菌可溶性抗原（Binax公司）、尿中大肠埃希菌O157可溶性抗原（Binax公司）均为免疫层析金标记的检验卡。另外，检查尿中特异性抗体为诊断微生物感染开辟一新途径。IgG性抗体易于自尿中排除，应用敏感的手段可以检出。Irel and 等报告了应用ELISA法检查尿中A型流感病毒IgG抗体来诊断流感患者。[8]国外报告自尿中检查抗HIV抗体，检查2599例与血清中抗HIV不符合者仅2% 。
　　自粪便中检查微生物抗原，为胃肠道致病菌的检查开辟一新的途径。应用EIA 法（Meridian Diagnostics公司试剂）检查粪便中的幽门螺杆菌抗原，PCR比较的特异性达94.6%，敏感性达88.9%。国内也有类似的报道。[9]
　　直接自患者咽拭或痰标本检出呼吸道病毒及肺炎支原体已有很大进展。我们应用单克隆抗体结合硝纤膜上的斑点EIA技术，已成功地自患者的咽拭标本中同时检出可能存在的肺炎支原体、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒和3、7型腺病毒。也有应用单克隆抗体APAAP染色技术以及FIA同时检出多种呼吸道病原体的报道。这些快速手段，利于及时鉴别细菌性、病毒性或肺炎支原体性的呼吸道感染而有针对性地合理使用抗生。
　　直接自脑脊液中EIA法检查肺炎链球菌的teichoic Acid 或Lipo taichoic Acid 可快速诊断肺炎链球菌性脑膜炎。
二、检查某些细菌的专有酶进行快速鉴定。Detection of specific enzymes of bacteria.
　　已发现某些具有特征性的酶，应用适当的底物可迅速完成细菌鉴定。如沙门氏菌具有辛酸酯酶，以4MU-辛酸酯酶为底物，经沙门氏菌酶解，在紫外灯下观察游离4MU的荧光，国内已有应用。[10]我们应用β-萘酚辛酯酶为底物，经沙门氏菌酶解，释出β- 萘酚与固兰作用出现紫色，反应在纸片上进行，只需5分钟即可完成沙门氏菌的鉴定。[11]这对食品与环境卫生检验有重要价值。卡他莫拉菌具有丁酸酯酶，可用丁酸酯色原底物快速鉴定。大肠埃希氏菌具β-葡萄糖醛酸酶，但以O157：H7为代表的肠出血性大肠埃希氏菌（EHEC）却不具此酶，故β-葡萄糖醛酸酶阴性已成为初步筛查EHEC的重要特征。检测此酶的底物有多种，我们运用对硝基酚-β-葡萄糖醛酸为底物不仅可快速鉴定大肠埃希菌、尚可在405 nm测定对硝基酚的释放量而定量，检测最低限可达100CFU/ml。定量检测在环境与食品卫生检验中极为重要，此法提供一新的手段。
　　白色念珠菌具脯氨酸肽酶及N-已酰β-D半乳糖苷酶，分别以适当物检测试验只需20分钟，两酶均阳性即为白色念珠菌。[12]
　　难辨梭菌是抗生素相关性肠炎及医院内感染的重要厌氧菌，常致成重要的伪膜性肠炎。该菌培养困难，诊断常检测其产生的A或B毒素。近来发现该菌具谷氨酸脱氢酶（GDH），但细菌培养需3-7天，如培养后再检查此酶，难以实现快速诊断。于是设法自粪便中直接检测此酶，应用此酶的IgG抗体（兔抗GDH）包被固相检测卡，应用双抗体夹心法检查粪便中的GDH。试验只需5分钟，已有商品的检测卡供应。如难辨梭菌Immunno Card(Meridian Diagnostics, InC)Staneck 等将此检测卡与细菌培养和细胞毒试验平行检查927份标本，表明其一致性95%，此法的敏感性是84%，特异性92%，阳性预示值63%，阴性预示值97%。[13] 现将快速鉴定用细菌的特异性酶列于表2。

表2 致病菌快速诊断用的特异性酶
脑膜炎奈瑟菌 γ谷氨酰转肽酶
淋病奈瑟菌羟脯氨肽酶（Hydroxyprolaminopeptidase）
A族链球菌吡咯芳胺酶（PYR）
肠球菌 PYR、亮氨酸氨肽酶（LAP）
沙门菌辛酸酯酶
大肠埃希菌 β葡萄糖醛酸酶
卡他莫拉菌丁酸酯酶
白色念珠菌脯氨酸氨肽酶、N-乙酰β-D半乳糖苷酶
克柔念珠菌酸性磷酸酶
热带念珠菌吡咯磷酸酶
新型隐球菌酚氧化酶
难辨梭菌谷氨酸脱氢酶（GDH）、脯氨酸酶
产单核李斯特菌丙氨酸氨肽酶
红斑丹毒丝菌 N-乙酰葡萄糖醛酸酶
加德纳菌 α葡萄糖苷酶
金黄色葡萄球菌 β- N-乙酰葡萄糖胺酶
腐生，中间，斯氏葡萄球菌 β半乳糖苷酶
霍乱毒素降解辅酶Ⅰ

三、快速检测细菌生化反应的色原或荧光底物及成套鉴定系统。Chromogenic or fluorescence substrates for rapid identification of bacteria.
　　国外以API为代表的细菌生化反应的成套系统中没，已用新型的色原或荧光底物代替传统的糖类和氨基酸。此种底物系由色原（呈色）或荧光与糖类或氨基酸人工合成。此底物无色，经细菌的细胞内或细胞外酶的作用而释放出色原（呈色）或荧光，其优点是特异性强，反应迅速，易于自动化检测，明显提高了细菌生化反应的准确性，实现了细菌生化反应革命性变化。
　　色原（荧光）糖苷结合物糖苷酶糖苷 + 色原（荧光）
　　色原（荧光）氨基酸结合物氨基肽酶氨基酸 + 色原（荧光）
　　常用呈色的色原有：α、β萘酚，邻位或对位硝基酚，对硝基苯胺，酚酞，2-氨4-硝基苯……
　　常用的荧光物有4-甲基伞形酮（4MU），7氨基4甲基伞形酮香豆素。以此类先进的生化反应底物为基础，已制成各菌属细菌鉴定装置，一次可做10-40项试验，反应结果可由人工或仪器判定，在通过编码得出鉴定结果。先进的细菌自动鉴定系统可在2-6小时完成鉴定，就是在鉴定系统中应用了此类色原或荧光底物。
四、应用不同载体的快速凝集试剂检查与鉴定微生物。Rapid agglutination tests by coated carriers.
　　所用的载体有聚苯乙烯粒子（Latex），明胶粒子、炭末、含蛋白A 的金葡萄球菌、胶体金、胶体硒等。商品试剂有自粪便中直接检出轮状病毒的Latex凝集试剂；自CSF中直接同时检出多种病原体的Latex凝集试剂（同时检出脑膜炎奈色氏菌、肺炎链球菌、b型流感杆菌（Bio Merienx公司），将白色、红色、黄色、兰色的Latex粒子分别结合不同的单抗、可快速将细菌分群。如沙门氏菌或链球菌与此种复合的Latex试剂作凝集反应，可在1-2分钟内依出现的凝集粒子的颜色而判定出A、B、C、D等群（Directigen）快速检查葡萄球菌的凝固酶或DNA的商品试剂应用更广。
五、快速检出细菌的毒素。Rapid detection of bacterial toxins.
　　自临床标本中直接检出细菌的毒素，常比细菌培养更可靠。如难辨梭菌在正常肠道中也可出现，故对抗生素相关性肠炎的诊断，检出其毒素比细菌培养更有意义。已应用此类毒素的单抗以快速凝集或EIA法自粪便标本中直接检出毒素A或B进行诊断。产毒素埃希氏菌（ETEC）感染的诊断主要依靠检查细菌的LT（热敏毒素）与ST（耐热毒素）可应用其单抗以多种免疫学手段检出。肠出血性大肠埃希氏菌（EHEC）的重要特征是产生Vero细胞毒素（VT）或称志贺样毒素（SLT）。由于EHEC的血清型繁多，生化反应也可不典型，故检查该菌的毒素极具诊断价值。英国Unipaih公司已研制出VTEC的PRLA乳胶凝集试剂分别检查VT-1与VT-2，试验时以多粘菌素裂解菌体，释出VT，与乳胶试剂在U形板中温育24小时，肉眼判定有无凝集。日本生研公司（Denka Seiken）的VIEC-RPLA也为快速凝集试剂。Bentin等注意到90%的VTEC在洗过的羊血肉汤平板上经37℃温育过夜可表现出溶血；而非溶血菌落均无VT或SLT基因。[15]这一发现为VTEC的检测提供一迅速的筛查方法。
　　金黄色葡萄球菌产生的多种肠毒素也用单抗的协同凝集试验迅速检出，是诊断该菌致成的事物中毒的可靠手段。应用反向被动乳胶凝集法（Oxoid公司试剂）快速检测葡萄球菌的TSST1，可及时诊断出由葡萄球菌致成的中毒性休克综合征。[16]
六、快速的细菌对抗菌药物的敏感性试验。Rapid susceptibility tests of bacteria to anti-microbiol drugs.
　　当前，检测细菌对抗菌药物的敏感性试验需用NCCLS推荐的方法与标准。新的检测手段，如分子生物学手段检测细菌的耐药基因，自动化的药敏试验仪器，E test法等可提高准确性与效率，但也难以实现快速。
　　快速纸片法（Nitrocefin）检查β内酰胺酶，对革兰阳性球菌，淋病奈瑟菌，流感嗜血杆菌，卡他莫拉菌有重要意义。
　　快速鉴定MRSA和MRCNS的快速乳胶凝集试验（日本生研公司）可检出变异的青霉素结合蛋白（PBP2a）经与mecA基因检测比较，其敏感性98.5%，特异性达100%。[17] 快速结核分枝杆菌药敏试验。BBL公司的MGIT（Mcobacterinm Growth Inhibitor Tube）于结核杆菌TH9培基中加入异菸肼，利福平等药物及荧光指示剂。荧光在有氧时淬灭，如细菌存活进行代谢而耗氧又复发荧光。在365nm的紫外灯下观察有无荧光而判定敏感或耐药，试验仅需4-5h.Jacobs等将荧虫酶的基因导入结核杆菌的噬菌体，噬菌体只侵入活的结核杆菌而发出荧光。将菌体与一定浓度药物作用后，如菌体存活则感染噬菌体，可在荧光显微镜下观察到荧光，即为耐药；无荧光者为敏感菌。
　　细菌代谢指示剂的应用。应用氧化还原指示剂，可指示存活细菌的代谢活动，其颜色的改变可由敏感的光度计测定，使检测时间明显缩短。已应用的指示剂TTC（氯化三苯四氮唑），MTT（3-（4，5 dimethylthiazol-2yl）-2,5 diphenyltetrazolium bromide）,后者优于前者。最新的敏感指示剂是Alamar blue,现已应用于革兰阴性杆菌，阳性球菌，酵母样菌，丝状真菌以及结核杆菌的MIC，对多数细菌4-6h即可判读结果。[18]
　　细菌对抗菌药物的敏感性反映一定的耐药机制，对正确鉴定细菌也有重要价值。[

回复人：wangsui,▲▲▲ (我不思故我不在) 时间：2005-09-27 19:24:31 编辑	3楼
接受答案了。

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